腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

AAV基因组结构

 rAAV包装纯化及滴度检测
      AAV包装过程中，包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒衣壳蛋白）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。另外，我们也可以根据使用者要求，提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013 VG/ml，完全可以满足各类整体实验的使用要求。

AAV包装流程图

滴度检测方法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

 rAAV侵染细胞过程
    纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。

rAAV作用机制

 rAAV载体优势
1、安全性高、免疫原性低：AAV是一种复制缺陷型DNA病毒，无自主复制能力，野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合，rAAV不整合。目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道，也是FDA批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。
2、宿主细胞范围广：AAV具有广泛的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
3、扩散能力强：AAV直径约20-26nm，体积小，滴度高，具有良好的扩散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。
4、体内表达基因时间长：AAV具有保持长期基因转录表达能力，体内表达一般3周可以达到高峰，随后持续高表达，作用时间＞5个月。
5、种类多样：AAV血清型众多，此外，根据不同的实验设计，我们还在不断的突变，筛选新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。

不同病毒的生物学特性比较

基于上述特点，AAV被视为是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中，与其他常用病毒工具载体相比，AAV具有感染过程温和长效的表达能力，是基因操作的利器。

 rAAV血清型选择
      目前已注册的AAV种类总数已超过196种，灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入，研究人员发现不同血清型的AAV之间可以杂交，而杂交后的AAV会兼有杂合双方的特点，因此，AAV亚型顺势诞生。
     现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力，同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性（不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性），表现出一定的器官靶向特异性。

不同血清型AAV的组织嗜亲性

小建议：如您不确定选择哪种血清型，可尝试使用Pandora’s Virus （AAV多种血清型）进行预实验，通过比较不同血清型对目标组织的感染效果，摸索最佳实验条件（注射方法、注射位点、病毒用量等），以便得到更理想的实验结果。
      Pandora’s Virus 详情：