一、siRNA 相关产品

二、siRNA产品运输与保存

◆产品经低温真空抽干以后以粉状态在常温下运输，收到产品后请置于-20*C~-80"C保存，干粉可以稳定保存一年，短期内若无实验计划，建议干粉保存。

◆RNA 以膜或干粉状态附着于管壁，开盖之前务必请瞬时离心，使用前加 RNase Free Water 溶解成20uM 的储存液，分装后置于-20*C~-80*C保存，以利于后续实验，且避反复冻融（最多5次），溶解后siRNA在-80*C可保存6个月。

◆siRNA 容易降解，所有操作需严格遵循RNA操作规则，实验结束后剩余储存液请及时保存于-20*C~-80*C。

三、使用前须知

化学合成siRNA一般为19nt + 3'-overhangs 的互补双链，其中19nt是由 RNA碱基组成的siRNA靶序列，此区域为互补双链，3'-overhangs 是悬垂于正反义链3-端的两个碱基，一般是由DNA碱基组成（也可以是RNA碱基），化学合成时分别合成正反义链，然后等摩尔量混合经 PCR仪退火形成双链。

◆正义链（Sense），或称 Passenger Strand，与靶基因上设计的靶点序列相同（U取代T），3'-端有两个悬垂DNA碱基；

◆反义链（Antisense），或称 Guide Strand，序列与靶点序列完全互补（U取代T），3'-端有两个悬垂DNA碱基；

◆本公司所有siRNA合成之后均经过RP-HPLC纯化，纯度在90%以上，且进过质谱质检，分子量正确；

◆本公司提供的siRNA均以摩尔为单位，一是便于退火时可以等量混合，二是转染时方便计算。且nmol、OD和μg之间可以互相转换，一般来说，一对21μp的siRNA平均分子量约为13300，不同单位之间转换有如下关系：1OD双链≈2.5nmol≈33μg

siRNA产品溶解为20μM储存液浓度所需的加水量，可简单参考下表：

四、细胞使用说明

siRNA 是通过转染的方式进入细胞，适用于磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法和阳离子脂质体试剂（如 Lipofectamine2000）等多种转染方法，严格按照各方法的操作步骤即可。一般根据细胞来选择具体的转染试剂和转染方法，对于容易转染的细胞，阳离子脂质体是较为常用的转染方法

为了保证实验的可重复性与可靠性，实验过程中需严格控制细胞密度、试剂用量、转染效率等因素对实验结果的影响，一般建议实验中每组至少3重复，同一批次实验所有孔内细胞密度保持一致且在孔内均匀分布，转染后监测转染效率，最好不要低于70%。

五、转染浓度选择与优化

在接种细胞之前，确保细胞状态良好。贴壁细胞转染密度推荐在50%左右；悬浮细胞推荐常规培养细胞数的1/3进行转染。转染时培养基中不能加抗生素，会降低转染效率和导致细胞死亡；为了获得更好的结果，可以使用 Invitrogen 的 Opti-Medium 低血清培养基在形成复合物前稀释Lipofectamin 2000和 siRNA。可以使用荧光标记的siRNA 帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定转染的最佳条件，可在每一次实验都包括荧光标记siRNA，作为转染效率的指示剂。

由于细胞类型及实验目的的不同，siRNA最佳的工作浓度也会有所变化，为获得有效的目的基因Knockdown 效果，初次实验强烈建议设置不同的浓度梯度进行优化，优化范围一般在10-100nM。若不做梯度摸索，初次实验转染浓度一般推荐用 50nM，但不能保证是最佳浓度，通常基因沉默分析至少在转染后的24-72h检测。为了达到高的转染效率，在实验过程中，需要注意以下几点：1）实验要在无RNase的环境下进行；2）细胞状态保持良好，建议使用对数生长期的细胞进行实验；3）避免使用抗生素；3）选择合适的转染试剂；4）通过荧光标记的转染对照分析 siRNA 的稳定性及转染效率进而优化实验。

六、实验对照设计

对于一个严谨的实验来说，除了敲低粑基因的实验组之外，还需要设计多组实验对照以确定实验不同环节的可靠性，常用的有以下几种对照组：

◆阴性对照组：用非特异性的siRNA序列证明RNA干扰作用的序列特异性一般是与目的细胞无同源性的通用阴性对照siRNA序列，也可以是目的siRNA序列打乱（scramble'的普通阴性对照，阴性对照是实验必需的；

转染试剂对照组：转染过程中不加任何 siRNA，用来排除转染试剂对细胞毒性或细胞成活率的影响；

◆空白对照组：转染过程中不加任何试剂，单独用来监测实验过程中细胞的生长状态；

◆阳性对照组：阳性对照作为一个实验系统检查很重要，可以用来确认siRNA 干扰实验的转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的；

◆转染对照组：用FAM荧光标记的通用阴性对照，用于优化转染条件和监测转染效率，FAM 标记与GFP 的荧光波长范围相差不大，可以直接以检测GFP的通道观察，需要注意的是FAM标记在转染之后荧光会逐渐淬灭，因此最佳的观察时间建议在转染之后的8h左右。

七、siRNA干扰效果检测

根据细胞种类、转染方法和检测手段的不同，最佳检测时间会有所差异，一般在转染后24-72h进行检测。

◆qRT-PCR检测靶基因mRNA水平，检测siRNA干扰效果最直接的方法，siRNA进入细胞后在RISC 系统下直接作用于靶细胞的mRNA，导致其被降解，因此通过qRT-PCR检测靶基因的mRNA 水平可直接反映siRNA是否起作用，一般在转染后的 24-48 小时检测，与对照相比可以看到靶基因mRNA水平明显下调。注：qRT-PCR引物的设计和质量很重要，

Western Blot 检测靶基因蛋白表达水平，对于蛋白编码功能基因来说，利用siRNA干扰的目的就是降低基因的蛋白表达水平从而研究该基因的功能，因此需要同时检测靶基因的蛋白水平。但由于蛋白表达水平受到多个过程调控，因此会有靶基因 mRNA水平下调而蛋白水平无明显变化的情况出现。

◆细胞功能学实验检测，对于已知功能的靶基因来说，还可以通过细胞功能学实验来检测siRNA的干扰效果，常规的比如细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移。

八、转染步骤举例

由于阳离子脂质体试剂的Lipofectamine2000目前使用广泛，且效果良好，故在此以Lipofectamine 的转染为例。下表为使用 Invitrogen 的 Lipofectamine 2000转染时的转染试剂及siRNA用量，siRNA初始储存液浓度为 20uM，仅供参考：

其中V1为完全或不完全培养基，铺细胞时使用，V2为 Opti-Medium，转染专用，无血清、无抗生素，一部分加转染试剂，一部分加siRNA转染步骤（以24孔板为例）：

准备细胞：

◆贴壁细胞：转染前一天，在400p无抗培养基中接种0.5-2x105个细胞，转染时细胞融合度为50%。（注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长）

◆悬浮细胞：转染前一天，在400ul无抗培养基中接种 0.5-2x105个细胞，转染时细胞数量应在4-8x105/孔L。

转染过程：

◆用50μl Opti-Medium稀释siRNA（转染细胞的终浓度为 50nM），轻轻吹吸3-5次混匀。

◆轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl Opti-Medium稀释1.2μl Lipofectamine 2000，轻轻吹打3-5次混匀，室温下静置5min，

◆混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min.

◆转染复合物加入到24孔细胞板中，100μV孔L，前后轻摇细胞板混合均匀。

◆细胞培养板置于37C、5% CO2培养箱中培养24-48h。转染4-6h后可换新鲜培养基。