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首页 >> 科研服务 >>细胞实验 >>敲除细胞株构建 >> CRISPR/Cas9敲除细胞系
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CRISPR/Cas9敲除细胞系

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商品说明

一、 技术简介

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CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术,也是目前研究最热的基因编辑技术。由于其具有构建方法简单快捷、基因修饰效率高、成本低廉、实验周期短、适用范围广等诸多优点,目前已成功应用于人类细胞、斑马鱼、大/小鼠等多种动植物的基因组精确修饰。

二、实验流程

1. 预实验

1.1 Cas9导入细胞方法:尝试各种方法,如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等,确定高效导入Cas9方法。

1.2 药物浓度预实验:降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

1.3 单克隆培养情况:确认细胞是否可以单克隆培养。

2. 基因敲除(敲入)

2.1 靶点设计:一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点,靶点位置尽量在基因CDS的前1/3,ATG之后,最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个,效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.2 载体构建和病毒包装:根据预实验结果,选择合适的普通载体或病毒载体(普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体)。

2.3 内源活性筛选:转染细胞或感染细胞48h后,使用Puro或Blasticidin筛选48h,提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性,将有效的突变型PCR产物测序验证。

2.4 Donor载体(基因敲入):根据筛选的gRNA靶点位置,构建Donor普通载体或腺病毒载体,共转染/感染Cas9-gRNA和Donor。

2.5 单克隆筛选:无限稀释到每孔1个细胞的数量,每株细胞铺至少2个96孔板。细胞数量足够后,验证内源活性并送测。

2.6 获得突变型:如需纯合子,则可能需要重复步骤3-5。

三、服务说明及结果

1. 客户提供:物种、基因名称、靶细胞。

2. 公司提供:验证成功的基因敲除细胞、基本实验步骤和测序验证结果等详细实验报告。

3. 实验周期:30-50个工作日。

 


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